O Exame Nacional de Ensino Médio (ENEM), surgido em 1998, é uma prova de conhecimentos interdisciplinares que tem por intuito avaliar o desempenho do estudante ao fim da escolaridade básica. Esse exame foi modificado em 2009, passando a ter 180 questões e a redação a serem respondidas em dois dias. Tais mudanças exigiram que as instituições escolares se adaptassem ao novo sistema educacional, visando o melhoramento na educação e o ingresso de pessoas que estão concluindo ou que já concluíram o ensino médio para o universo do ensino superior. Um dos materiais mais importantes nesse contexto é o livro didático. Ele é instrumento indispensável para as instituições escolares, considerado uma ferramenta decisiva para a qualidade do aprendizado no ambiente escolar. O objetivo desse trabalho é averiguar se os livros didáticos de biologia do ensino médio estão de acordo com a matriz de referência- ciências da natureza e suas tecnologias- do ENEM. Essa investigação foi baseada a partir da escolha de dois livros didáticos de Biologia aplicada ao Ensino Médio, sendo um escrito antes das adaptações do ENEM em 2009 e outro, após as modificações no exame. Os conteúdos exigidos foram: Estudo das moléculas, células e tecidos, hereditariedades e diversidade da vida, identidade dos seres vivos, ecologia e ciências ambientais, origem e evolução da vida e qualidade de vida dos seres humanos. O livro “Biologia Hoje” precisa sofrer modificações para auxiliar na aprendizagem e aprovação dos alunos no ENEM, pois alguns aspectos exigidos na matriz do exame foram encontrados ainda deficientes.