No Brasil, a Lei de Diretrizes e Bases da Educação Nacional estabelece Ensino Médio como a última de três etapas da Educação Básica. O Exame Nacional do Ensino Médio (ENEM) se caracteriza como um dos mecanismos de avaliação desse nível de ensino. É um instrumento avaliativo realizado em todos os estados brasileiros e, além de ser um meio de ingresso ao Ensino Superior, também é utilizado como fator avaliativo para a qualidade do ensino no país, exercendo grande influência sobre os currículos do Ensino Médio, fazendo com que os fazeres pedagógicos tendam a se adequar à estrutura, competências e habilidades que compõem essa avaliação. A presente pesquisa propôs-se a realizar levantamento e categorização das temáticas de Biologia abordadas pelo ENEM entre 2020 e 2024. Os cadernos de provas das últimas cinco edições do exame, disponibilizados de modo eletrônico pelo site oficial do INEP foram tomados como documentos e analisados, a partir de elementos da análise de conteúdo proposta por Bardin para identificar as questões da área de Biologia e categorizá-las, de acordo com a Matriz de Referência do ENEM, estabelecendo-se aquelas mais abordadas pelo referido exame. Foram identificadas tendências predominantes, tendo sido Moléculas, células e tecidos e Ecologia e Ciências Ambientais os temas mais presentes nas edições analisadas. A partir dos resultados, é possível discutir de que modo o ENEM atua na produção dos currículos de Biologia do Ensino Médio, além de contribuir para que professores/as de Biologia conheçam um pouco mais sobre as abordagens do referido componente curricular no ENEM.