A pesquisa teve como objetivo geral realizar análise bibliográfica dos autores que abordam metodologias aplicadas ao ensino da Biologia no Ensino Médio, identificação e caracterização das principais dificuldades de aprendizagem dos conteúdos de Biologia dos alunos do terceiro ano do Ensino Médio do Instituto Federal do Piauí / Campus Piripiri, como subsídio para inserção de metodologias mais eficazes e ativas para o ensino da disciplina. Utilizando uma abordagem qualitativa e quantitativa, foi conduzido um estudo de caso com a aplicação de questionários online em 4 (quatro) turmas do terceiro ano para identificar as dificuldades dos alunos e avaliar as metodologias utilizadas. Os alunos afirmaram, em sua maioria, 12 (doze) sentem dificuldade para se concentrarem durante as aulas teóricas ministradas em sala. Dentre os conteúdos de maior dificuldade os alunos apontaram Bioquímica e Citologia. Outro ponto a ser citado diz respeito ao sentimento de frustração ou ansiedade que os alunos apresentam por não conseguir assimilar o conteúdo ou focar nas aulas de Biologia em sala de aula. Mais da metade dos alunos optaram por aulas práticas no laboratório ao invés de aulas em sala de aula como o de costume. As aulas práticas e as metodologias não se limitam a apenas ao laboratório, podendo então, transformar os mais diversos locais em um cenário saberes significativos.