A seca é um dos fatores que mais limitam a produção agrícola em ambientes áridos e semiáridos. Nestas regiões o uso de genótipos tolerantes tornou-se uma importante ferramenta para garantir a produção de culturas de alto valor comercial, como o amendoim. A utilização de espécies selvagens no melhoramento do amendoim é vista de forma promissora, por agregar genes relacionados com a tolerância à seca. Destaque-se que a compreensão detalhada da expressão de genes relacionados com atividade antioxidante e acúmulo de solutos pode auxiliar na seleção de materiais promissores. No presente estudo foram quantificadas a expressão diferencial, a atividade antioxidante das isoformas de superóxido dismutase (SOD) e o conteúdo de prolina em folhas de anfidiploides de amendoim submetidos à supressão hídrica. Foram avaliados sete anfidiploides RC1F4 oriundos do retrocruzamento BR 1 x [BR 1 x (A. batizocoi K9484 x A. duranensis SeSn 2848)4x]. Esses genótipos foram previamente selecionados de uma população constituída de 64 materiais, onde o crivo de seleção se baseou no desempenho fisiológico e agronômico em condições de seca. A cultivar Senegal 55-437 e a linhagem LViPE-06 foram utilizadas como controles tolerante e sensível à seca, respectivamente. O cultivo foi realizado em vasos (30 L) instalados em casa de vegetação na sede da Embrapa Algodão, Campina Grande-PB. As plantas foram irrigadas diariamente, mantendo umidade próxima a 100% da capacidade de campo. A supressão da irrigação foi iniciada na antese, sendo a coleta do tecido vegetal realizada no quinto dia de supressão. A expressão relativa e a atividade das isoformas de SOD dos sete anfidiploides foram superiores a verificada para a linhagem sensível (LViPE-06), o que é indicativo de maior tolerância ao estresse. Por outro lado, maior expressão relativa do gene ∆¹-pirrolina-5-carboxilato sintetase (P5CS) e conteúdo de prolina livre foram verificados na LViPE-06, indicando que o acúmulo de prolina não foi a principal linha de resposta dos anfidiploides à seca. A análise conjunta da expressão gênica, atividade antioxidante e conteúdo de prolina evidenciou que a intensidade das respostas moleculares e bioquímicas depende do genótipo, o que proporcionou diferentes níveis de tolerância entre os anfidiploides. Os anfidiploides 53 P4 e 96 P9 são promissores para o uso em programas de melhoramento visando à ampliação da base genética e a síntese de cultivares com tolerância ao estresse hídrico.