Hemigrammus marginatus tem como localidade-tipo a bacia do rio Itapicuru, pertencente ao Grupo Norte da ecorregião Mata Atlântica Nordeste (NMAF). Além de ocorrer em outras bacias da NMAF, a espécie também é registrada para ecorregião São Francisco (SF). O compartilhamento de espécies de peixes entre a NMAF e SF reforça a hipótese que conectividade histórica entre estas ecorregiões, que nunca foi testado em níveis menos inclusivos (i.e, populacional). Neste contexto, o presente estudo teve como objetivos investigar, descrever e analisar o padrão filogeográfico de H. marginatus nas ecorregiões NMAF e SF. Para tanto, foram obtidas e analisadas sequências do marcador mitocondrial COI de amostras de todas as bacias da MNAF onde há registro da espécie e também em afluentes da SF. A topologia resultante da análise filogenética recuperou o monofiletismo das populações analisadas com um alto valor de suporte, embora as relações internas entre espécimes de diferentes localidades não foram bem resolvidas. As análises filogeográficas indicaram a existência de nove haplótipos distintos com apenas um compartilhamento de haplótipos entre populações de H. marginatus, além de uma sutil estruturação dentro da NMAF, com poucos passos mutacionais de distância. O cenário testado na AMOVA que melhor explica a atual distribuição da espécie foi a hipótese de conexões passadas entre o São Francisco, Vaza-Barris e Itapicuru. A análise de demografia histórica indica que a espécie passou por uma rápida expansão populacional. Os resultados obtidos ajudam a corroborar a conectividade pretérita entre as ecorregiões SF e NMAF especialmente através de afluentes da margem direita do rio São Francisco e da bacia do rio Itapicuru.
