Resumo Trabalho

USO DE POLIPEPTÍDIO ELASTINA-LIKE PARA PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNA NS1 DO VÍRUS DENGUE EXPRESSA EM PLANTA

Autor(es): KALIL ANDRADE MUBARAC ROMCY e orientado por MARIA IZABEL FLORINDO GUEDES

A dengue é uma doença causada por um flavivírus com quatro sorotipos e é transmitida , principalmente, pelo mosquito Aedes aegypti. O genoma desse vírus possui RNA de fita simples e codifica uma poliproteína que após o processamento origina três proteínas estruturais e sete proteínas não estruturais. A proteína não estrutural NS1 pode apresentar-se de diferentes formas: extracelular, quando secretada, ou permanecer intracelular associada a membrana do retículo endoplasmático e até mesmo celular, aspecto relevante em aplicações biotecnológicas. Com o crescente emprego de plantas para a produção de antígenos recombinantes foram desenvolvidos métodos de otimização desta plataforma. Inclui-se neste método o direcionamento, por inserção de peptídeos, à compartimentos subcelulares na célula. Uma vez que o endereçamento à diversos compartimentos, como apoplasto, vacúolo, retículo endoplasmático (ER), citoplasma, são possíveis, dependendo da proteína, pode haver alteração do comportamento da mesma à nível celular, o que reflete na aplicação da metodologia de purificação proteica, que deve adaptar-se às características da proteína. No presente trabalho aplicou-se a técnica do ciclo de transição inversa (ITC), que emprega sal para precipitação seletiva de proteínas solúveis, à um extrato vegetal de plantas infiltradas com vetores portadores da sequência da proteína NS1, do vírus dengue, direcionada ao ER. Efetuou-se a técnica em diversas concentrações de sal e temperatura. O extrato bruto contendo sulfato de amônio foi homogeneizado cuidadosamente por inversão e incubado à 23ºC. Em seguida efetuou-se uma centrifugação, o sobrenadante 1 (S1) foi removido, o pellet foi ressuspendido em tampão fosfato (PBS) 1X (contendo 0,1% (v/v) de Tween-20) gelado para ressolubilizar as proteínas, posteriormente foi efetuada outra centrifugação. Logo após, o segundo sobrenadante (S2) contendo a proteína solubilizada foi coletado. Posteriormente à purificação, foi realizado eletroforese em gel de poliacrilamida, seguida de transferência para membrana de PVDF, para análises de western blotting das proteínas purificadas pelo método TCI. A NS1 foi expressa no sistema vegetal, porém as análises do gel revelaram uma recuperação de aproximadamente 75% da proteína de interesse no S2, sugerindo, desta forma, que cerca de 25% da proteína acumula-se no pellet (que comumente é descartado nestes procedimentos), logo, o endereçamento celular ao compartimento do retículo endoplasmático (ER) provavelmente fez com que a proteína fosse inserida na membrana desta organela, uma vez que a mesma encontrou-se também na forma insolúvel.Desta forma, conclui-se que a NS1 recombinante foi expressa em sua forma sóluvel e também associada a membrana do ER da célula vegetal, e que uma metodologia alternativa para a extração da NS1 do dengue vírus, com um endereçamento ao ER, é necessária para um melhor aproveitamento da mesma em expressão heteróloga na plataforma vegetal.

Veja o artigo completo: PDF